MST微量热泳动技术能够弥补传统的互作技术在高样品消耗、小分子检测以及操作繁琐等方面的不足，能够轻松高效地检测各类具有挑战的样品，因而快速地被应用在各种领域。

　　下面是我们的技术专家们精心挑选的9篇高分文献，为大家解读MST技术是如何在四个不同应用方向助力科学研究的。

　　帕金森病(PD)的病理表现是α-synuclein的聚集，α-synuclein 被认为是治疗帕金森病的一个潜在靶点。中药天麻中联苯苄型化合物20C，可显著增强PD模型的细胞活力，可能是天麻治疗PD的重要生物活性成分。然而，其作用靶点和作用机制尚不清楚。今年中国医学科学院药物研究所发表在Cell Death and Disease的研究结果发现，小分子20C可抑制α-synuclein 聚集并阻止PD的进展，并且明确了这些改善是来自20C和α-Syn fibrils的直接互作。

　　α-Syn fiber是由α-Syn单体组装而成的大聚集体，分子量超过420kD，而20C为小分子，二者之间分子量倍数差别在几百倍以上，很难通过基于分子量变化方法进行互作亲和力检测。

　　来自第二军医大学以及中国医学科学院药用植物研究所的张卫东团队在Signal Transduction and Targeted Therapy杂志上撰文，报道了黄芪甲苷优化衍生物HHQ16通过直接作用于心肌细胞逆转肥厚，有效地逆转了心肌梗死诱导的心肌重构，并改善了心功能。研究者对一个新发现的人类 lncRNA(Lnc4012) 及其小鼠同源基因(Lnc9456)进行了全面的鉴定，并对lnc4012/lnc9456在心肌梗死诱导的心肌肥大和心力衰竭的发生发展中的作用提供了新的机制见解，并证明lnc4012/lnc9456是一种新的真正的靶点。

　　在研究过程中，研究者通过病理及药理实验确定了lnc9456为HHQ16逆转肥厚和心衰的特异性靶点，

　　而HHQ16与lnc4012/lnc9456的结合会导致其降解，从而拮抗其对心肌细胞G3BP2/NF-κB信号的作用，从而有效地逆转心肌梗死引起的肥厚和心力衰竭。

　　研究者首先构建了拟南芥ABP1生长素结合位点突变形式的ABP1-5转基因植株，表型分析发现其与tmk突变体类似，呈现明显的生长发育和生长素快速响应缺陷，暗示ABP1-5蛋白可能通过对其他质外体定位的，生长素结合蛋白产生显性负效应，参与TMK介导的生长素信号通路。由于ABP1没有同源基因，为了寻找其他的生长素结合蛋白，研究者通过检索TMK1互作蛋白质组学数据库，鉴定到两个新的生长素结合蛋白，其与ABP1氨基酸序列相似性偏低，但结构类似，且具有高度保守的生长素结合区域，将其命名为ABL1（ABP1-like protein 1）和ABL2。通过生化分析，发现ABL1蛋白定位于质外体，与ABP1类似，研究者提出了科学假设--细胞膜ABLs-TMK蛋白复合体感知并传递胞外生长素信号。

　　表型分析发现：ABL1/2与ABP1的功能具有冗余性，但又有别于ABP1，差异性调控植物的生长发育；ABL1/2与ABP1都通过协同TMK家族，介导生长素的快速响应。

　　作者研究发现柱头的乳突细胞表面的受体FER/ANJ/HERK1/CVY1与乳突细胞自分泌小肽sRALF33等组分协作构建成锁，阻止花粉管穿入柱头。自己的花粉以及近缘植物种的花粉携带的7个旁分泌小肽pRALF11/26等即为钥匙，该“钥匙”打开柱头处的锁，使得花粉管可以穿入柱头。在研究过程中，

　　。这也是瞿礼嘉/钟声团队继2017年Science和2022年Science后第三次用MST检测蛋白和多肽的亲和力。

　　仅需要 200nM 100uL 的蛋白样品，即使进行多组实验，也仅需要非常少量的蛋白样品。MST结果显示，选定的sRALF33、pRALF11或pRALF26分别可以与FER、CVY1、ANJ和HERK1相互作用，并具有高亲和力。

　　研究团队建立了一个工程系统，用于将这些脂化模拟物整合到大肠杆菌和哺乳动物细胞中几乎任何所需的蛋白质位置。这项研究策略能够实现数百种蛋白质脂化的功能获得研究，促进了卓越治疗候选药物的创造。

　　在该研究中，为了证明基因编码脂质模拟物在设计和合成治疗候选药物中的效用，

　　武汉大学中南医院、武汉大学医学研究院王行环团队此前的研究显示POLD1是膀胱癌恶性转变过程中的一个关键分子。在此基础上，王行环团队证实POLD1在膀胱癌组织中较癌旁组织高表达，在肌层浸润性膀胱癌中较非肌层浸润性膀胱癌高表达，且与预后相关。团队在体内和体外实验中证明了POLD1能够促进膀胱癌的增殖和转移，并在进一步机制研究中发现，POLD1通过与FBXW7竞争性结合MYC，从而减弱FBXW7介导的MYC泛素化降解。此外，机制研究还发现POLD1可以与MYC形成复合物参与MYC的转录调控，增强MYC的转录活性；另一方面，MYC能够转录激活POLD1，从而形成了一个POLD1-MYC正反馈回路，增强了对膀胱癌的促癌作用（图7）。这项研究成果于2023年发表在 Nature Communications 杂志。

　　研究人员首先通过CO-IP验证了POLD1与MYC的结合，而当去掉MYC中与FBXW7α结合的区域MB1后，就检测不到结合了。因此研究团队合成了MB1肽段，然后

　　使用MST技术检测了POLD1与MB1肽之间的亲和力，并与 FBXW7α作对比，证明POLD1对MB1的亲和力比FBXW7α强，因此它可以与FBXW7α竞争结合MYC

　　（图8）。在这个实验中，POLD1和FBXW7α 也都是与GFP融合表达在293T细胞，直接使用细胞裂解液作为target进行检测，无需纯化蛋白。

　　研究人员基于二维组合筛选进行RNA和小分子高通量分子间相互作用检测，发现了一些可以与pre-miRNA-155结合的小分子。

　　，其他RNA凸起或者点突变RNA在相同检测浓度范围内看不到明显的结合信号。

　　小分子结合于pre-miRNA-155的非活性位点，并不会对细胞内的miRNA-155表达水平产生影响。接下来研究人员构建了双功能小分子核糖核酸酶靶向嵌合体，一端与目标RNA结合，另一端招募并激活RNA酶，从而靶向降解目标RNA。改造后的嵌合体成功在细胞内降低miRNA-155的表达水平，并且在细胞和小鼠模型中抑制了三阴乳腺癌。

　　为了测试该方法的适用性，研究人员又构建了靶向MYC和JUN的核糖核酸酶靶向嵌合体。这两种蛋白都是重要的癌症靶点，但都是无序蛋白，被认为是不可成药的。改造后的核糖核酸酶靶向嵌合体获得了生物活性并在细胞内精准地靶向降解各自的靶向RNA，使这些癌蛋白驱动的转录和蛋白组学进程失效。这项研究表明对于由这些常见但具有挑战性的致癌基因驱动的癌症，重编程非活性小分子为靶向RNA降解剂可能会带来新的变革。

　　2023年北京大学药学院汤新景教授开发出一种新颖且便捷的光触发位点特异性RNA编辑系统，并将研究成果发表在Cell Chemical Biology上。为了开发内源性ADAR蛋白的A-to-I可控的编辑策略，作者设计了一种末端有胆固醇修饰的反义寡核苷酸（3’-笼式arASO）：由一段2’-OMe修饰的可编程反义域、用于与靶mRNA杂交的硫代磷酸修饰的3’端和位于5’端的用于招募ADAR蛋白的工程化GluR2 R/G基序组成，这种设计能通过招募内源性的ADAR蛋白来实现位点特异性的RNA A-to-I编辑。并且，作者通过2D细胞和3D肿瘤球的实验验证了3’-笼式arASO在的光触发A-to-I编辑能力。

　　为了研究3’-笼式arASO抑制位点特异性的机制，作者使用MST技术检测了3’-笼式arASO与蛋白和核酸的互作：ADAR1-p150是主要的RNA单碱基编辑器。

　　MST技术检测3’-笼式arASO与不配对的腺苷的单链靶RNA（ssRNA）的结合亲和力检测结果表明：3’-笼式arASO在没有光刺激的情况下与ssRNA（A·C错配）的结合亲和力比其阳性对照的结合亲和力低17.4倍，但在给予光照后，其亲和力恢复到与阳性对照组相当的水平（左图）。这表明，在3’-笼式arASO的反义结合域3’端的胆固醇修饰阻断了其与ssRNA（A·C错配）的结合。而胆固醇修饰对arASO与完全配对的ssRNA的结合亲和力没有影响（右图）。

　　睾丸核受体4 (TR4)调节基因的转录激活，在许多疾病中发挥重要作用。TR4对靶基因的调控涉及通过DNA结合域(DBD)与DNA分子的直接相互作用。然而，TR4与靶基因之间特异性的相互选择性机制不清楚。2023年中国农业大学陈忠周教授课题组在Nucleic Acids Research在线发表了题为

　　通过对TR4-DBD - DNA复合物晶体结构分析，第129、138等残基起到结合的关键作用，

　　。Y129A、K138A、K142A、R143A和R146A突变对结合的破坏最为明显，其他突变也在不同程度上削弱了二者的互作。

　　d值。TR4结合了这些靶基因的每个启动子，并且结合亲和力随序列的不同而不同（图14），表明结合亲和力的差异可能与dsDNA结合位点的序列特征有关。

　　晶体结构分析表明，DNA含有两个重复的AGGTCA基序，与两个DBD分子形成异三聚体复合体。为了确定AGGTCA中的最佳基序，作者构建具有相同位点突变的dsDNAs，并进行了MST实验。亲和力结果表明，A1G2G3T4C5A6位点替换G2和T4对结合影响最明显，结合亲和力降低了百倍（图15），说明G2G3T4C5对TR4结合的靶基因至关重要，推断序列PuGGTCA是TR4的最佳目标基序。

　　希望2024年MST技术依旧能够在分子互作检测上大放异彩，在各个领域助力科研学者取得成功！

　　帕金森病(PD)的病理表现是α-synuclein的聚集，α-synuclein 被认为是治疗帕金森病的一个潜在靶点。中药天麻中联苯苄型化合物20C，可显著增强PD模型的细胞活力，可能是天麻治疗PD的重要生物活性成分。然而，其作用靶点和作用机制尚不清楚。今年中国医学科学院药物研究所发表在Cell Death and Disease的研究结果发现，小分子20C可抑制α-synuclein 聚集并阻止PD的进展，并且明确了这些改善是来自20C和α-Syn fibrils的直接互作。

　　α-Syn fiber是由α-Syn单体组装而成的大聚集体，分子量超过420kD，而20C为小分子，二者之间分子量倍数差别在几百倍以上，很难通过基于分子量变化方法进行互作亲和力检测。

　　作者使用MST技术检测了 α-Syn fibrils 与20C的互作（Kd为37μM），证明二者之间存在直接互作。

　　来自第二军医大学以及中国医学科学院药用植物研究所的张卫东团队在Signal Transduction and Targeted Therapy杂志上撰文，报道了黄芪甲苷优化衍生物HHQ16通过直接作用于心肌细胞逆转肥厚，有效地逆转了心肌梗死诱导的心肌重构，并改善了心功能。研究者对一个新发现的人类 lncRNA(Lnc4012) 及其小鼠同源基因(Lnc9456)进行了全面的鉴定，并对lnc4012/lnc9456在心肌梗死诱导的心肌肥大和心力衰竭的发生发展中的作用提供了新的机制见解，并证明lnc4012/lnc9456是一种新的真正的靶点。

　　在研究过程中，研究者通过病理及药理实验确定了lnc9456为HHQ16逆转肥厚和心衰的特异性靶点，

　　并通过MST实验验证了HHQ16与lnc9456具有高亲和力结合，但与抗肥大lncRNA Mhrt无亲和力（图2）。这表明了HHQ16与lnc9456特异性结合，导致其降解的药效机制。

　　研究者利用MST技术验证了新的小分子HHQ16会与lnc4012/lnc9456特异性结合。而HHQ16与lnc4012/lnc9456的结合会导致其降解，从而拮抗其对心肌细胞G3BP2/NF-κB信号的作用，从而有效地逆转心肌梗死引起的肥厚和心力衰竭。

　　研究者首先构建了拟南芥ABP1生长素结合位点突变形式的ABP1-5转基因植株，表型分析发现其与tmk突变体类似，呈现明显的生长发育和生长素快速响应缺陷，暗示ABP1-5蛋白可能通过对其他质外体定位的，生长素结合蛋白产生显性负效应，参与TMK介导的生长素信号通路。由于ABP1没有同源基因，为了寻找其他的生长素结合蛋白，研究者通过检索TMK1互作蛋白质组学数据库，鉴定到两个新的生长素结合蛋白，其与ABP1氨基酸序列相似性偏低，但结构类似，且具有高度保守的生长素结合区域，将其命名为ABL1（ABP1-like protein 1）和ABL2。通过生化分析，发现ABL1蛋白定位于质外体，与ABP1类似，研究者提出了科学假设--细胞膜ABLs-TMK蛋白复合体感知并传递胞外生长素信号。

　　表型分析发现：ABL1/2与ABP1的功能具有冗余性，但又有别于ABP1，差异性调控植物的生长发育；ABL1/2与ABP1都通过协同TMK家族，介导生长素的快速响应。

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